在對生命本源的幻想中，人們總是前往隱秘之處尋找“不老泉”，而事實(shí)上，生命不老的秘密或許在它最小的單位中——

3月26日，我國科學(xué)家首次鑒定出使衰老間充質(zhì)干細(xì)胞重獲活力的“年輕因子”——多梳蛋白4(CBX4)，并對其功能進(jìn)行了驗(yàn)證，相關(guān)研究成果發(fā)布于《細(xì)胞報(bào)道》上。

幾天后的4月1日，《公共科學(xué)圖書館·生物學(xué)》發(fā)表了同一科學(xué)家團(tuán)隊(duì)的另一個全新發(fā)現(xiàn)，首次在人間充質(zhì)干細(xì)胞中確立了“年輕通路”——YAP-FOXD1，并證明該通路的激活可減輕細(xì)胞衰老及骨關(guān)節(jié)炎。

如果說前者是科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了“不老泉眼”，那么后者的研究則是“兩點(diǎn)一線”地確定了細(xì)胞生命的“青春之河”。

“該研究揭示了YAP-FOXD1通路在人干細(xì)胞去衰老及骨關(guān)節(jié)炎基因治療中的作用與分子機(jī)制。”論文通訊作者之一、中國科學(xué)院生物物理研究所研究員劉光慧介紹，研究由中科院生物物理所劉光慧研究組同北京大學(xué)湯富酬研究組、中科院動物所曲靜研究組合作完成，研究團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)五年的努力從縱橫交織的細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，證明了YAP-FOXD1通路的存在，并通過細(xì)胞和動物水平的實(shí)驗(yàn)證明了它的功能。

為癌基因“正名” YAP蛋白充當(dāng)“年輕因子”

YAP-FOXD1通路中最先撞入科學(xué)家視野的是YAP蛋白。網(wǎng)上搜索YAP蛋白的“簡歷”，可以發(fā)現(xiàn)，與它關(guān)系最密切的是一條被業(yè)內(nèi)稱為“河馬通路”的Hippo信號通路。

“河馬通路”的上游一旦接收到抑制生長的信號，經(jīng)過一系列激酶磷酸化反應(yīng)后，最終以磷酸化的形式作用于下游效應(yīng)因子YAP蛋白，決定YAP蛋白的磷酸化與否。

如果不被磷酸化，沒有磷酸化基團(tuán)“尾巴”的拖累，YAP便能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)入基因調(diào)控的大本營。這時YAP扮演的是“傳令官”，它在大本營里的出現(xiàn)引來基因的活躍，它會選擇與自己的靶基因結(jié)合，“傳令下去”，催促靶基因表達(dá)出相應(yīng)的RNA和蛋白質(zhì)，從而影響細(xì)胞的生命活動。

“我們首先找到了YAP，它是一個功能明確的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子。”劉光慧說，在細(xì)胞核里YAP可以和它的轉(zhuǎn)錄因子“伙伴”TEAD結(jié)合，共同激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。

YAP如果帶上了磷酸化基團(tuán)的“尾巴”，就會被阻滯留在細(xì)胞質(zhì)中，YAP無法到細(xì)胞核中“傳令”，下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到抑制，細(xì)胞增殖也會受到抑制。

有報(bào)道指出，如果YAP進(jìn)行頻繁“傳令”、不受節(jié)制，將會讓細(xì)胞無限制增殖，進(jìn)而可能引發(fā)腫瘤，因此被認(rèn)為是一種“癌基因”。

YAP的特性給了研究團(tuán)隊(duì)兩個任務(wù)：一是從功能上證明，它的存在與否是否與細(xì)胞的“年輕態(tài)”相關(guān);二是它如何把“命令”傳遞下去進(jìn)而調(diào)控功能基因的功能呢?它的“接令員”是誰，之前有沒有被其他科學(xué)家找到呢?

為回答第一個問題，團(tuán)隊(duì)從正反兩個角度進(jìn)行驗(yàn)證。“我們通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一系列可以延緩人類間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的蛋白。這些蛋白敲除后細(xì)胞會出現(xiàn)加速衰老的表型。”論文第一作者、中國科學(xué)院生物物理研究所博士生付麗娜說，基因敲除的工作開始于人胚胎干細(xì)胞，通過導(dǎo)入3種不同質(zhì)粒，研究團(tuán)隊(duì)讓人干細(xì)胞基因組中負(fù)責(zé)編碼YAP蛋白的那段基因發(fā)生缺失。

“敲除的基因組DNA大概是幾千個堿基，雖然敲除幾個堿基也可能使得YAP因子失去功能，但是很可能導(dǎo)致新的異常蛋白的產(chǎn)生，從而引入無法排除的因素。”付麗娜說。團(tuán)隊(duì)必須確保YAP基因的完全沉默。為此，他們對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行了改良，使其能夠?qū)薮蟮腨AP基因位點(diǎn)進(jìn)行較大片段的刪除。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，團(tuán)隊(duì)獲得了YAP特異性敲除的人胚胎干細(xì)胞，通過定向分化技術(shù)，將人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。“YAP缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的加速衰老表型。”劉光慧說，YAP在維持人成體干細(xì)胞年輕態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，雖然YAP在某些腫瘤細(xì)胞中被證明具有“癌基因”的功能，但在人間充質(zhì)細(xì)胞中卻扮演著“年輕因子”的角色。

全新的“兩點(diǎn)一線” 找到Y(jié)AP蛋白“鐵桿伙伴”和“接令員”

YAP通過與轉(zhuǎn)錄因子TEAD的相互作用來啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，也就是說TEAD和YAP是“鐵桿伙伴”。此前研究發(fā)現(xiàn)，YAP和TEAD通過YAP的N末端和TEAD的C末端間相互作用形成蛋白復(fù)合物，該蛋白復(fù)合物在YAP介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

團(tuán)隊(duì)的第二個任務(wù)是尋找YAP的“接令員”。“我們假設(shè)YAP的某個或某些靶基因介導(dǎo)了人間充質(zhì)干細(xì)胞年輕態(tài)的調(diào)節(jié)。”劉光慧說，“通過系列實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)YAP可以轉(zhuǎn)錄激活FOXD1，這是一個新型的YAP靶基因，之前從未被報(bào)道過。”

叉頭框(FOX)蛋白家族包含50多個轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、衰老調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。FOXD1是其中一個轉(zhuǎn)錄因子。付麗娜解釋，之前有報(bào)道指出FOXD1能調(diào)節(jié)器官發(fā)育，并具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞重編程的活性。

“我們首先對YAP敲除的人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序，進(jìn)一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的預(yù)測，我們推斷FOXD1可能是YAP的一個新型靶基因。”付麗娜說，隨后，為了驗(yàn)證推斷，團(tuán)隊(duì)利用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法“釣”出能夠特異性地結(jié)合FOXD1啟動子DNA的蛋白(即YAP)，最終證明是FOXD1從YAP處接過“命令”，開啟調(diào)節(jié)細(xì)胞“年輕化”的分子程序。

“YAP是上游，F(xiàn)OXD1是下游。它們是一對命運(yùn)共同體。”劉光慧解釋，隨著細(xì)胞衰老，YAP和FOXD1的表達(dá)都發(fā)生了一致性下調(diào)。

或助力基因治療 未來可有效干預(yù)衰老相關(guān)疾病

從干細(xì)胞出發(fā)，發(fā)現(xiàn)機(jī)制機(jī)理，再回到細(xì)胞、生命體驗(yàn)證，“青春之河”的發(fā)現(xiàn)必須在生物體中證明自己的“魔力”。

“我們在三種細(xì)胞衰老模型中證明了YAP-FOXD1通路的去衰老作用，YAP或FOXD1的過表達(dá)能使衰老的人間充質(zhì)干細(xì)胞重新獲得增殖能力。”付麗娜說。另一方面，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示了過表達(dá)YAP或FOXD1可能使衰老的動物間充質(zhì)組織(如關(guān)節(jié))變得更加年輕。

團(tuán)隊(duì)接下來在動物身上實(shí)施了基因治療。“我們在小鼠體內(nèi)證明了YAP或FOXD1蛋白的過表達(dá)作為骨關(guān)節(jié)炎基因治療方案的可行性和有效性。”劉光慧說，團(tuán)隊(duì)以慢病毒載體為基因?qū)朊浇椋瑢⒕幋aYAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨關(guān)節(jié)炎的小鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)。數(shù)周的YAP或FOXD1基因治療均可顯著降低關(guān)節(jié)軟骨中衰老細(xì)胞的比例，有效抑制關(guān)節(jié)軟骨退化及關(guān)節(jié)腔炎癥，從多個方面改善骨關(guān)節(jié)炎的病理表型。

骨關(guān)節(jié)炎是典型的與細(xì)胞衰老關(guān)系密切的人類疾病。這些研究結(jié)果均證明，通過基因?qū)敫杉?xì)胞“年輕因子”，有望在未來治療以骨關(guān)節(jié)炎為代表的衰老相關(guān)疾病。找對“不老泉眼”或者“青春之河”，將為基因治療提供明確的標(biāo)靶，最終對衰老相關(guān)疾病的干預(yù)提供有效的解決方案，并進(jìn)行臨床應(yīng)用。